Diagnosen af botulisme er baseret på identifikation af Clostridium botulinumtoksinet i laboratoriet og på observation af kliniske symptomer, selvom de nogle gange ikke er specifikke. Sygdommen kan faktisk forveksles med Guillain-Barré syndrom, poliomyelitis, slagtilfælde, myasthenia gravis og tærskelforlamning.
I fødevare botulisme er billedet af neuromuskulære lidelser og indtagelse af potentielt forurenet mad vigtige spor. Samtidig manifestation i mindst 2 patienter, der spiste den samme fødevare, forenkler diagnosen. Bekræftelsen opnås ved at isolere mikroorganismen med dyrkningstesten af mistænkte fødevareprøver eller fæces af patienten og med identifikation af botulinumtoksin i fødevarer eller biologiske materialer (såsom blod, mavesaft og opkastning).
I sårbotulisme bekræfter diagnosen af serumtoksin eller isoleringen af Clostridium botulinum fra en hudlæseprøve dette.
